За 30 років, які пройшли з часу, коли феномен необхідної фізіологічної загибелі клітини отримав назву “апоптоз”, з’ясовані у тій, чи іншій мірі його біологічна значимість у здоровому організмі, біохімічні та морфологічні зміни, що супроводжують клітину впродовж апоптозу, а також деякі молекулярні механізми цього процесу. Паралельно продовжують накопичуватися свідчення про місце апоптозу у розвитку патологічних процесів, зокрема новоутворень [1, 2]. Основні дослідженя з цієї проблеми проведені на культурах клітин, а також клітинах пухлин людини і експериментально індукованих пухлин у тварин. По відношенню до останніх, як зазначають дослідники, далеко не всі результати, що одержані на моделях індукованого канцерогенезу, можуть пояснити процеси, які відбуваються у клітинах спонтанних злоякісних пухлин [3]. Крім того, показано, що злоякісні пухлини людини характеризуються, зазвичай, більш високим апоптозним індексом, ніж пухлини експериментальних тварин [1]. В той же час дослідження апоптозу у клітинах спонтанних пухлин тварин проводиться у край недостатньому об’ємі, хоча останні можуть бути природніми моделями для вивчення механізмів канцерогенезу. Так, наприклад, собаки є єдиним видом тварин, для яких показано спонтанне виникнення запальної карциноми молочної залози [4], яка у людей є найбільш злоякісною. У цьому огляді дуже стисло наведені дані про основні механізми і прояви апоптозу та його можливу роль у канцерогенезі. Певні акценти зроблено на дослідженнях механізмів апоптозу у спонтанних пухлинах тварин, зокрема пухлинах молочної залози собак та кішок, які є чи не найпоширенішими пухлинами у цих тварин [5].

Значення апоптозу як нормального активного клітинного процесу заключається у тому, що будучи комплементарним, але протилежним іншому фундаментальному процесу – проліферації, він відіграє важливу роль у контролі величини клітинної популяції [6]. Динаміка морфологічних змін у клітинах впродовж апоптозу вивчена на цей час достатньо повно, бо сама ідентифікація цього процесу була проведена морфологічними методами. Найбільш ранніми змінами, які наступають вже через 15 хв після ініціації апоптозу, є зменшення кількості мікроворсинок. Ці зміни оборотні, вони виникають тоді, коли ще немає ознак пошкодження ні ядер, ні мембран. Конденсація хроматину та формування його осмофільних скупчень біля ядерної мембрани починає відбуватися в кінці першої години, а через 4-5 год – мікроворсинки повністю зчезають і на клітині починають утворюватися пузирчатовидні вздуття. Це має місце лише у клітинах з конденсованим хроматином [7]. Пізніше з’являються вдавлення ядерної мембрани та відбувається фрагментація ядра. У цитоплазмі спостерігається розширення ендоплазматичного ретикулюма, конденсація та зморщування гранул. Відшнуровані фрагменти ядра, а також конденсовані і оточені мембраною органелли опиняються поза клітиною (апоптичні тіла).

Вміст апоптичних тіл різниться в залежності від типу клітини і від того, які частини її потрапили у випинання. Маленькі тіла іноді повністю складаються з конденсованого хроматину, в той час інші утворені лише елементами цитоплазми із щільно розміщеними органелами, які можуть у певних межах зберегати метаболізм. Сама ж клітина стає округлою, зморщується, зменшується в об’ємі, гублячи контакти із клітинами, що її оточують, і відокремлюється від субстрату. Важливою особливістю цього процеса є відсутність пошкодження мембрани клітини [1, 2].

Зморщування ядра відбувається лише на завершальних стадіях апоптозу. Хроматин конденсується не повністю, що свідчить про збереження активності деяких ділянок ДНК. Така динаміка процеса загибелі клітин і її морфологія встановлені за допомогою електронного мікроскопа. У разі світлової мікроскопії на гістологічних зрізах з ряду причин апоптоз визначається з певними труднощами. Апоптична загибель торкається лише окремих клітин і гістологічно проявляється утворенням великих та маленьких, сферичних і овальних еозинофільних цитоплазматичних фрагментів, частина з яких містить пікнотичні залишки ядер. Останні є інтенсивно базофільними і краще розрізняються у випадку їх скупчення у міжклітинному просторі, але це буває рідко. Мілкі тіла у світловому мікроскопі не видні [2]. Вважають, що присутність фрагментів ядра (Фелген-позитивні гранули) є діагностичним критерієм: якщо тіло клітини містить ядерні фрагменти – це апоптоз, якщо не містить – це або апоптозне тіло, або аутофагальна вакуоль. Ряд дослідників все ж вважає, що апоптоз можна бачити як на звичайних гістологічних препаратах, так і на полутонких зрізах [1].

Апоптичні тільця швидко фагоцитуються не тільки макрофагами і нейтрофілами, але і іншими клітинами, для яких фагоцитоз не є специфічною функцією [8]. У подальшому розпаді фагоцитованих апоптичних тіл важливу роль відіграють лізосомальні ферменти, а залишкові тіла виводяться із клітини. Цікаво, що лізосоми апоптичних клітин залишаються інтактними впродовж усього процесу апоптозу впритул до їх розщеплення у фаголізосомах. Тривалість усього процесу і кожної фази варіює; показано, що апоптичні тіла можуть утворюватися та зчезати впродовж 12-24 год. У новоутвореннях апоптозні тіла фагоцитуються частіше пухлинними клітинами. Проте, вони можуть залишатися у тканині, злущуватися у просвіт органа, потрапляти у кровоносні судини і канальця нирок. На етапі утворення апоптичних тіл та початку їх фагоцитування клітина ще жива. Певно, в цьому і є задача апоптозу – утилізація ще живих апоптичних тіл. Це перешкоджає потраплянню вмісту вмираючої клітини у позаклітинне середовище і не викликає явищ запалення, характерних для некрозу [1].

Назагал, апоптоз у клітинах різних тканин має певні молекулярні та морфологічні особливості. Він має раптовий початок і його ранні стадії відбуваються дуже швидко. Різні типи клітин реагують на вплив різних факторів з неоднаковою швидкістю; більш того, реакція різних клітин однієї популяції на один і той же стимул також може відрізнятися і тому апоптоз клітин за цих умов не є синхронним. У розвитку цього процесу викреслюють дві (формування і проведення апоптичних сигналів та демонтаж клітинних структур [9]), або три фази (індукторну, ефекторну та стадію деградації [10]). Дві останні, певно, близькі чи однакові для усіх різновидів апоптозу, в той час перша має специфічні особливості в залежності від типу клітин та факторів індукції.

Феномен апоптозу є результатом дії різноманітних чиників. Це можуть бути неспецифічні зовнішні фактори, такі як температура, токсичні агенти, гіпоксія, гамма- та УФ-опромінення, а також внутрішні, насамперед, гормони, цитокіни, пептидні фактори росту, високий рівень Са²⁺ тощо [11]. Ініціація апоптозу може відбуватися як шляхом рецептор-опосередкованого, так і рецептор-незалежного сигнальних механізмів.

Серед індукторів апоптозу, які потребують для своєї дії специфічних мембранних рецепторів, насамперед, викреслюють цитокіни і, в першу чергу, фактор некроза пухлин (TNF). Рецептори TNF (TNFR1 та TNF2) мають у своїй будові цитоплазматичну ділянку (“домен смерті”), функцією якої є передача апоптичного сигналу (схема). На мембранах клітин різних типів локалізуються, крім того, рецептори, для яких встановлена лише саме така специфічна функція. На цей час, крім TNFR, ідентифіковано ще біля 10 мембранних молекул, які мають внутрішньоклітинний “домен смерті”, що зв’язує рецептори із механізмами реалізації апоптоза. Найкраще на цей час охарактеризований “рецептор смерті” Fas (CD95, APO-1) [12], який конституітивно експресується на поверхні клітин багатьох типів. Серед інших виділяються 7 близькоспоріднених білків, частина з яких функціонують, як сигнальні (DR3, DR4, DR5, DR6), а інші діють як приманки, конкуруючи з білками першої групи за ліганд (DcR). Цікаво, що апоптоз, опосередкований цими рецепторами відбувається у нормальних клітинах рідко, тоді як він широко представлений у клітинах злоякісних пухлин [13].

Природніми лігандами для “рецепторів смерті” є трансмембранні білки, які виявляють разючу структурну гомологію, мають аналогічні механізми впізнавання рецепторів та запуску апоптозy; усі вони є цитокінами. Розчинна форма Fas-ліганда (FasL) утворюється шляхом активації металопротеаз [14]. FasL присутній на мембранах більшості типів клітин, насамперед, цитотоксичних Т-лімфоцитів, клітинах-кіллерах та клітинах імунологічно привілейованих зон (епітелій та ендотелій сім”яників, строма ока, клітини Сертолі). Для рецепторів DR4 та DR5 лігандом є TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), для DR3 –TRAMP.

У разі Fas-залежного апоптозу активація “рецепторів смерті” під впливом стимулбованих антитіл або FasL (який зазвичай активується на лімфоцитах) приводить до тримеризації рецептора, і, як наслідок, до конформаційних змін у цитоплазматичному “домені смерті” [15], що сприяє можливості подальшого зв’язування рецептора з білками-адаптерами, які містять другий, ефекторний, “домен смерті”. Для Fas адаптерним білком є FADD (Fas-associated death domain) [16].

Наступний білок, що зв”язується з ефекторним “доменом смерті” FADD, на С-кінцевій частині містить структуру, що є гомологічною структурі однієї з цистеїнових протеаз сім’ї каспаз. Цей білок носить ім”я прокаспази-8. Прокаспаза-8 та прокаспаза-1 залучаються до олігомеризованного Fas і формують рецепторний комплекс, що трансдукує сигнал загибелі [17]. Прокаспаза-8 у цьому комплексі підлягає аутокаталізу з утворенням активної каспази-8. Далі формується активний гетеродимер каспази-8 і це означає включення універсальної стадії розвитку апоптозу, пов’язанної із каспазним каскадом (див. далі). Для TNFR1 адаптером визначений білок із двома “доменами смерті” (TRADD), у цьому комплексі (в який входить також білок-посередник RIP) проходить активація каспази-2 [18].

У клітинах різних типів ідентифіковані білки, аналогічні вірусним і у яких, незважаючи на гомологію із каспазою-8, відсутня ферментативна активність. Ці інгібітори містять два ефекторних “домени смерті”, зв’язуються з Fas у рецепторному комплексі, що гальмує утворення активної каспази-8 [19] і, як наслідок, гальмують апоптоз, індукований різними “рецепторами смерті”. В той же час, загибель клітин, яка індукується рядом гормонів, опроміненням, фармакологічними препаратами та через перфорин-гранзим, не гальмується цими внутрішньоклітинними інгібіторами [20]. Ці апоптичні сигнали реалізуються на початкових етапах по рецептор-незалежним механізмам. Сигналом до розвитку апоптозу у цьому випадку є зміни транскрипції генів, продукти яких регулюють просування клітини по циклу, або генів, які кодують експресію компонентів механізму апоптозу.

З”ясовано, що фактори транскрипції, відповідальні за активацію клітинного циклу, приймають також участь і у реалізації апоптозу. До них, насамперед, відносять гени передраньої відповіді. Як і при проліферації, за апоптозу спочатку активується експресія прото-онкогена c-fos, а потім гена c-myc. Продукт гена c-fos взаємодіє з членами сім”ї білків c-jun з утворенням комплексу, який регулює транскрипцію ряду цільових генів. Підвищення експресії генів c-fos та c-jun відмічено за умов апоптозу, який був індукований різними стимулами, зокрема сигналами ембріонального розвитку, при загибелі нейронів від гіперзбудливості, у разі деяких генетичних мутацій, а також за умов нестачі факторів росту [21]. Вважають, що у нормі функціональна експресія гена c-fos короткочасна, тривала активація гена передує загибелі клітини. Дерегуляція експресії гена с-myc, особливо у комбінації із блокадою клітинної проліферації внаслідок зниження факторів росту, приводить до активації циклін-залежних кіназ, що має наслідком вихід клітини з циклу та автоматичний розвиток апоптозу.

До механізмів виходу клітин з циклу має відношення і інший фактор транскрипції, який також відіграє важливу роль у включенні апоптозу за умов зниження рівня факторів росту, порушенні міжклітинних взаємозв’язків, гіпоксії внаслідок недостатності кровообігу, різноманітних стресах, пошкодження ДНК при дії токсинів або радіаційному чи УФ-опроміненні, вірусних інфекціях, надекспресії онкогенів, порушенні клітинної архітектури, скорочення до критичного рівня довжини теломер. Цей фактор – білок р53, продукт гену р53 дикого (нормального) типу. У структурі білка р53 викреслюють декілька доменів; кожний з них має специфічну функцію, а саме: відповідає за регуляцію транскрипції, зв”язування з ДНК, олігоізомеризацію р53, який функціонує у вигляді тетрамера [22]. Показана висока структурна гомологія білка р53 дикого типу різних видів савців [23].

У непошкодженних клітинах, які нормально діляться, р53 є дуже нестійким. Його нестабільність залежить від білка MDM2, зв’язок з яким робить білок р53 доступним для розщеплення. Причиною стабілізації р53 є зміни його фосфорилювання та взаємозв”язку з MDM2 у відповідь на порушення ДНК. За цих умов час полужиття р53 значно підвищується, як і його експресія, що приводить до накопичення білка і транскрипції цільових генів, продукти яких відповідають за зупинку клітинного циклу у фазі G1/S (таких як, наприклад, waf, bax, гена, що кодує експресію фактора проліферації ядерного антигена (PCNA), гена затримки росту) [24]. Експресія генів myc та bcl-2 за умов підвищення активності р53 інгібується.

Відомо, що підтримання цілосності генома після пошкодження ДНК залежить від узгодженої дії системи репарації ДНК та контролю за клітинним циклом. З цих позицій, помірне збільшення рівня дикого типу р53 викликає підвищення експресії PCNA, який необхідний для репарації ДНК, але в той же самий час сприяє зв”язуванню інгібітора циклін-залежних кіназ (експресію якого контролює ген waf) з PCNA, що індукує PCNA-опосередкований синтез ДНК та блокує клітинний цикл у фазі G1. Зупинка клітинного циклу у фазі G2 також відбувається за участю р53 [25]. Блокада циклу до початку реплікації ДНК та мітозу дозволяє репарацію пошкодженної ДНК і попереджує, тим самим, виникнення мутантних клітин. Якщо ж активність репараційних систем недостатня і пошкодження ДНК зберігається, то клітина іде по шляху апоптоза, що захищає організм від клітин, здатних до злоякісної трансформації. Отже, сутність захисного механізму дії р53 є підвищення часу для репарації ДНК або залучення апоптичних компонентів у захист організму від небезпечних мутацій [26]. В той же час, р53 є найбільш мутуючим геном у клітинах злоякісних пухлин людини та тварин. Цікаво, що серед мутацій гена р53 зустрічаються і такі, завдяки яким білок-супресор губить свої функції фактора транскрипції, але залишає здатність до участі в апоптозі [27].

До активації каспаз, тобто до переходу апоптозу у стадію, загальну для усіх шляхів індукції цього процесу, приводить і початковий етап запуску загибелі клітин при дії на них цитотоксичних Т-лімфоцитів або природніх клітин-кілерів. У цих випадках у мембрані клітин-мішеней внаслідок полімеризації перфорину (компонента цитотоксичних гранул) формуються пори, через які у клітину проходять гранзими – протеази, функцією яких є розрив пептидних зв’язків біля залишків аргініну. Серед субстратів для гранзимів є деякі неактивні попередники каспаз, які активуються під впливом дії цих ферментів. Перша з каспаз на шляху гранзима В – це каспаза-10 – важливий фактор ініціації каспазного каскаду: вона відповідає за активацію інших каспаз, зокрема 3, 4, 6, 7, 8 та 9 [28].

Аналізуючи шлях апоптозу від первинного сигналу до смерті або, принаймі, до масової активації каспаз, дослідники викреслюють етап, на якому відбувається “вибір” між реалізацією програмованої загибелі та можливістю виживання клітини [29]. Після трансдукції сигналу регуляторами його виступають білки сім”ї Bcl-2/Bax, що пов’язані із плазматичною, ядерною, мітохондріальними мембранами та ендоплазматичним ретикулюмом [30]. Ця сім’я складається як із промоутерів (Bad, Bax, Bcl-x_S, Bik, Bid, Bak, Bim), так і супресорів (Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-w, Bag-1, Mcl-1) апоптозу. Показано, що ключовим моментом у рішенні клітини, чи йти по шляху апоптозу, є гетеродимеризація білків Bcl-2. Цьому сприяє існування в їх структурі спеціальних доменів, за допомогою яких антагоністи апоптозу гетеродимеризуються з білком Bax, а агоністи утворюють гетеродимери з білками Bcl-2 та Bcl-x_L. Одним із механізмів, через які ці білки отримують сигнал до регуляції апоптозу, є зміна структури внутрішньоклітинних індукторів апоптозу – Bad та Bax. За умов їх фосфорилювання утворення гетеродимерів Bcl-2/Bad та Bcl-2/Bax не відбувається і апоптоз не розвивається. Дефосфорилювання Bax та Bad і утворення димерів сприяє запуску апоптозу за рахунок вивільнення апоптичних мітохондріальних факторів [30].

Ще одна можливість обмеження функції Вcl-2 обумовлена його взаємодією з Bag-1 та цитоплазматичним доменом рецептора деяких факторів росту. За умов відсутності цих факторів Bag-1 зв’язується із Bcl-2 і це захищає клітину від апоптоза. У разі взаємодії Bag-1 з рецептором факторів росту Bcl-2 вивільнюється, що підвищує можливість розвитку апоптозу [30]. З’ясовано, що Bcl-2 може захистити клітину від апоптозу навіть у присутності високого рівня білка р53 дикого типу. [31]. Це свідчить про те, що його дія спрямована на елементи сигнального шляху, який є наступним за активацією р53 [32]. Отже, комбінація та баланс між усіма Bcl-2-індукторами та Bcl-2-інгібіторами складає единий механізм керування та визначає вибір клітини на контрольній точці апоптозу [33].

В останні роки при порівнянні різних клітинних ліній по їх відношенню до запуску сигнального шляху було ідентифіковано два типи клітин [15]. Для першого сигнал, що передається через Fas, не залежить від активності мітохондрій, для другого – мітохондрії посилюють ініціацію каспазного каскада. Активація мітохондрій відбувається за участю ще одного з членів сім”ї Bcl-2 – Bid, який є субстратом для каспази-8. Молекула Bid після дії фермента (tBid) транслокується до мітохондрій та індукує там олігоізомеризацію Bax та Bak [34], що призводить до зниження електрохімічного градієнта мембрани.

Деполяризації мембран мітохондрій сприяють також високий рівень Са²⁺ та значна концентрація сполук активного кисню. Суттєве значення при цьому має відкриття електрозалежних аніонних каналів, які діють у місцях контакту зовнішньої та внутрішньої мембран. Відкриття цих каналів на внутрішній мембрані приводить до вирівнювання концентрації йонів у межах матриці та простору у мембрані, а це зменшує електрохімічний градієнт та роз’єднує ланцюг дихання, який веде до утворення АТФ. Показано, що це має місце перед фрагментацією ДНК, тобто є найбільш раннім проявом апоптозу. У стані високої провідності канал стабілізується у відкритій позиції і починає пропускати у білкову мембранну матрицю воду та великі молекули. Це викликає набряк мітохондрій; внутрішня мембрана, яка має значно більшу поверхню, ніж зовнішня, справляє тиск на останню, що веде до її розриву та виходу проапоптичних факторів у цитоплазму [35].

До таких факторів відносять, в першу чергу, AIF (apoptosis inducing factor), ендонуклеазу G, цитохром С та Apaf-1 (apoptosis protease activating factor-1) [15]. Двоє останніх разом із АТФ та прокаспазою-9 об’єднуються разом, формуя комплекс, який відомий як апоптосома. Apaf-1 не має жодної каспазної активності, але зв’язування з ним дозволяє активації прокаспази-9 шляхом аутокаталіза, а зв’язок Apaf-1 із цитохромом С робить перший спроможним до зв’язування з прокаспазою-9. Таким чином, вихід цитохрому С із мітохондрій вважають ключом для сигналу, який, активуючи каспазний каскад, починає необхідні події загибелі клітин [36]. В свою чергу, AIF активує каспазу-3 та ендонуклеазу G незалежно від цитохрома С та знижує трансмембранний потенціал мітохондрій [35]. Відомо багато хіміотерапевтичних агентів, що індукують вивільнення AIF з мітохондрій, в той час як антиапоптичні молекули, наприклад Bcl-2, гальмують його транслокацію.

З наведеного вище видно, що різні сигнальні шляхи закінчується універсально – активацією каспаз. Ці цистеїнові протеази синтезуються як неактивні проферменти і активуються шляхом розщеплення у специфічних місцях, що містять залишки аспарагінової кислоти. Деякі з них послідовно активують інші, внаслідок чого встановлюється певна ієрархія каспаз. На цей час у людини ідентифіковано 14 каспаз, які за своїми функціональними особливостями можуть бути cуто умовно розділені на три групи: 1) активатори цитокінів (каспази 1, 4, 5, 13); 2) індуктори активації ефекторних каспаз (каспази 2, 8, 9, 10); 3) ефекторні каспази – “виконавці” апоптоза (каспази 3, 6, 7) [9]. Інактивація каспаз внаслідок мутацій відповідних генів, дії інгібіторів, вірусних білків та білка-інгібітора апоптозу попереджує розвиток цього процесу. Зважаючи на таку важливу роль каспаз у реалізації апоптозу, з біохімічної точки зору самозагибель клітини за цим механізмом вважають як клітинну смерть, індуковану каспазами.

З активацією каспаз пов’язаний масовий протеоліз цитоплазматичних білків, мікрофіламентних, субмембранних структур, проте, безпосереднє відношення до розвитку апоптозу мають ядерні мішені каспаз. Деякі з них вже ідентифіковані. Це ряд ферментів, пов”язаних із репарацією та реплікацію ДНК, білки, що відповідають за структурну організацію хроматину, за сплайсинг mРНК, за контроль клітинного циклу, інгібітори нуклеаз, фактор фрагментації ДНК та ін. Питання про природу ферментів, які відповідають за деградацію хроматину за апоптозу, все ще далеке від свого вирішення. Не виключено, що у різних клітинах цей процес каталізується різними ферментами [1].

Розщеплення ДНК проходить у декілька етапів з утворенням все більш мілких фрагментів: спочатку розміром біля 300 тис. пар основ (т.п.о.), дещо пізніше до 30-50 т.п.о. Ці етапи фрагментації ДНК пов”язані із протеолітичним розщепленням каспазами специфічного білка топоізомерази ll, який виконує структурну та ферментативну функції і приймає участь у формуванні суперспіралізованих петель, що містять по 50 т.п.о. з утворенням ще більш складної структури із 300 т.п.о. Саме на цій стадії відбувається конденсація хроматину та інвагінація ядерної мембрани, що, як зазначалося вище, є одними з перших морфологічних проявів апоптозу. Далі настає міжнуклеосомна дезінтеграція ДНК з утворенням фрагментів, що кратні за величиною 180-190 п.о. Це відповідає довжині нитки ДНК у межах однієї нуклеосоми або кратній їй по величині.

Деградація хроматина за апоптозу є активним процесом, що залежить від температури, джерел енергії, синтеза РНК та білка de novo. Безпосередньою причиною апоптичної загибелі клітин, як вважають, є не деградація ДНК або припинення роботи генів, бо морфологічні та біохімічні зміни у цитозолі та мітохондріях, характерні для апоптозу, можуть бути індуковані і в енуклеінованих клітинах, а також у ядрах, які знаходяться поза клітиною. Клітини можуть вступати в апоптоз на будь-який стадії клітинного циклу, але чутливість їх до апоптичних стимулів при цьому різна [1, 9, 29].

Зниження здатності клітин до апоптозу, що відбувається за допомогою різних механізмів, відіграє суттєву роль у розвитку багатьох пухлин. Найбільш повно вивченими є механізми, пов’язані із мутаціями у генах, контролюючих апоптоз, а також пара- та аутокринним збільшенням експресії факторів росту та рецепторів до них, що виникає внаслідок активації онкогенів у клітинах, які накопичили певну кількість генетичних змін. В ряду процесів, пов’язаних із мутаціями у генах, що мають відношення до програми самозагибелі клітин, знаходяться, передусім, мутації та оверекспресія гена bcl-2, білковий продукт якого, як зазначено вище, гальмує апоптоз, а також мутації гена р53, які перешкоджають функціонуванню кодуємого їм білка як індуктора апоптозу. Це у багатьох випадках є ключовими механізмами у збільшенні маси пухлинного клона [2, 22].

Мутантний білок р53 проявляє всі властивості онкобілків. Він не має здібності зупиняти клітини із ушкодженою ДНК у фазі G1 циклу і вони починають реплікацію ДНК на ушкодженній матриці, що приводить до виживання клітини, яка була призначена до загибелі. Мутантний білок р53 може також безпосередньо перешкоджати репарації ДНК та підвищувати чутливість її до пошкодження. Ці події приводять до виникнення генетичної нестабільності, гальмують апоптоз і сприяють злоякісній трансформації [2, 24, 26].

В останні роки встановлено, що мутації гена р53 є універсальною і критичною ланкою у прогресії більш, ніж 50% пухлин людини і тварин [32]. Вони супроводжуються перебудовами у короткому плечі хромосоми 17, де знаходиться цей ген. Більшість мутацій гена р53 при злоякісних пухлинах людини пов’язані із ділянками між кодонами 126-306, зафіксованих на екзонах 5-8. У разі злоякісної трансформації у тварин мутації у вигляді перестановок, зрощування окремих частин, утворення безсмислових ділянок були знайдені майже у тих же екзонах (2-8) [37, 38]. Так в аденокарциномі молочної залози собак мутації зустрічалися у 249 кодоні 7 екзона [39] та 162 кодоні 5 екзона [40], у солідній пухлині молочної залози кішки заміна однієї амінокислоти встановлено у 8 екзоні гена-супресора р53 [23]. Серед 25 зразків карцином молочної залози було виявлені 5 мутацій р53 у вигляді перестановок (одна пухлина мала 2 мутації) та 1 мутація у вигляді утворення безсмислової ділянки. [41]. Не виявлено жодного зв’язку цих мутацій із гістологічним типом пухлини або породою собак. Більшість з цих мутацій локалізувалися на регуляторному, ДНК-зв’язуючому доменах та домені, що відповідає за олігоізомеризацію р53 [42]. Відхилення спостерігали як в обох алелях гена (2 випадки з 7 пухлин з мутаціями), так і в одній (5 з 7), що знижує функцію аллелі гена дикого типу р53 [42, 43]. Дія цих мутацій реалізується внаслідок зв”язування нормального гену р53 та гальмування його функції.

Накопичення мутантного білка р53 знаходять у великій кількості випадків різних злоякісних пухлин людини. Так, у пухлинах молочної залози це спостерігали у 23% випадків. Пухлини були дуже агресивними і не містили рецепторів естрогенів. У клітинах первинного раку печінки мутантний білок р53 виявлено у 44% випадків, у пухлинах яєчників – у 50%, в пухлинах товстої кишки – у 75%. До пухлин з високою частотою мутації р53 відносять злоякісні меланоми, рак легень, сечового міхура та передміхурової залози. В той же час існують пухлини, у яких фактично не відбувається мутацій цього гена – це сіміноми, деякі види лейкозів та мієломна хвороба [32].

Дещо інша картина з’ясована при аналізі пухлин тварин. Серед 226 проаналізованих пухлин собак найбільш часто накопичення мутантного р53 виявлено у разі плоскоклітинного раку шкіри, аденокарцином носа та перианальних залоз. В той же час у гемангіоперицитомах, перехідних клітинних карциномах, аденокарциномах молочної залози та кишки, злоякісних пухлинах тучних клітин і гістіоцитомах мутації гена р53 зустрічаються рідко [44]. У кішок з 486 зразків пухлин, одержаних від 77 тварин, найбільш часто мутації гену р53 спостерігали у разі плоскоклітинного раку шкіри (46%), остеосаркомах (50%), карциномах молочної залози (33%), аденокарциномах різної локалізації (16%) та гемангіомах (14%). Жодна із досліджених злоякісних лімфом або фібросарком не виявляла накопичення мутантного білка р53 [45]. Щодо власне пухлин молочної залози то дані літератури дуже суперечливі. Використовуючи два типи моноклональних антитіл до різних епітопів гена р53, було показано, що у переважній (75%) більшості різних за гістологічними характеристиками пухлин молочної залози собак виявляється надекспресія мутантного р53 [46]. В інших дослідженнях частота мутацій та накопичення білка р53 була нижчою – 40% [38], 31% [47], 17% [48] та 10% [39]. Встановлено, що лише у остеосаркомах молочної залози собак (20 %) спостерігали середню або значну експресію мутантного гена, тоді як в аденокарциномах та злоякісних міоепітеліомах вона була відсутня або мала фокусний характер [49]. Цікаво, але деякі автори вважають, що збільшення експресії р53 асоціюється виключно із карциномами молочної залози кішок, бо в своїх дослідженнях не виявили експресії мутантного білка р53 у цих пухлинах собак [50].

Мутації у гені р53 є також одним із факторів метастазування пухлин, так як дозволяє пухлинним клітинам тривалий час перебувати без підтримки специфічного мікрооточення, що у нормі завершується безумовним апоптозом. Багатофакторний регресійний аналіз виявив, що мутації у гені р53 є незалежним фактором ризику для рецидування пухлини та загибелі тварин від раку молочної залози [48].

Факт, що у деяких пухлинах білок р53 не експресується зовсім [51], підтверджуює висновок, що у нормі ген р53 дійсно є геном-супресором пухлинного росту. У деяких пухлинах інактивація функції гену р53 має місце із-за гіперекспресії білка MDM2, який підвищує його розпад. Зокрема, це спостерігається і у різних пухлинах собак, у тому числі пухлинах молочної залози [52]. Отже функція гену р53 може гальмуватися не тільки за рахунок мутацій самого гена а і за домогою інших механізмів, проте, кінцевим результатом є припинення функції дикого типу гена р53, що, з точки зору його ролі у розвитку апоптозу, приводить до гальмування процесу самозагибелі трансформованої клітини.

До такого ж ефекту веде і мутації bcl-2 та надекспресія білка Bcl-2. Мутація, за якої ген bcl-2 транслокується зі своєї нормальної позиції у 18-й хромосомі у локус гену тяжких ланцюгів імуноглобуліну 14-ої , викликає злоякісну трансформацію В-лімфоцитів шляхом транскрипційної дисрегуляції гену та гіперекспресії білка Bcl-2. Збільшення рівня експресії bcl-2 може бути обумовлено не тільки транслокацією генів, але і недостатнім метилюванням, що запобігає нормальній регуляції його функції [32].

По відношенню до гена bcl-2, дані щодо частоти його гіперекспресії у пухлинах людей також різняться: у деяких із них (рак передміхурової залози) надекспресія є негативним фактором у плані результатів терапевтичної дії, для інших (рак легенів, молочної залози, нейробластоми), навпаки, встановлено, що чим вища експресія гена bcl-2, тим краще пухлини піддаються терапії [32], внаслідок якої пухлинні клітини помирають за апоптичним механізмом. Цікаво, що у хворих на рак молочної залози гіперекспресія гену bcl-2 спостерігається у 2/3 випадків, вона корелює із експресією рецепторів до естрогенів і прогестерону. Така різниця у наслідках надекспресії Bcl-2 може бути пов”язана з тим, що у різних типах пухлин роль білка може відрізнятися. При дослідженні 180 пухлин кішок спостерігали подібну до людини локалізацію експресії bcl-2 у пухлинах різних органів, зокрема у карциномах молочної залози [53].

Гіперекспресія bcl-2 часто сполучена із транслокацією генів сім’ї myc [54]. Посилення проліферації одночасно із затримкою циклу і апоптозу за умов відсутності дії на клітину факторів росту в нормі спрямовано на обмеження накопичення проліферуючих клітин. Мутація c-myc супроводжується роз”єднанням цих функцій, а саме: онкобілок c-Myc виключає апоптоз або активуючи ген bcl-2, або перешкоджаючи активації комплекса Apaf і цитохрома С. Взаємодія генів bcl-2 та myc може приводити до появи та накопичення трансформованих клітин внаслідок посилення їх проліферативної активності за зміни експресії c-myc та гальмування процесу апоптичної загибелі клітин, пов’язаної із дією продукта bcl-2. Так, з’ясовано, що у механізмах дії печінкового фактора росту, який блокуючи апоптоз, відіграє важливу роль у процесах інвазії пухлин молочної залози, важливими є підвищення рівня білка Bcl-x_L та експресії c-Myc [55].

Значний інтерес мають дані про те, що специфічні вірусні гени можуть індукувати активність гена bcl-2, що є сигналом до виживання та захисту інфікованої клітини від апоптозу. Такі клітини можуть жити довгий час поки інший сигнал трансформації, наприклад за транслокації генів myc, не індукує останній етап, який супроводжується посиленням проліферації клітин та злоякісною трансформацією [56]. Отже механізм порушення апоптозу приймає участь і за умов вірусного канцерогенезу.

Частота зустрічаємості підвищенного рівня експресії с-myc у пухлинах молочної залози собак по даним різних авторів дуже варіює. Так, серед 20 досліджених злоякісних пухлин підвищення експресії с-myc виявлено в одному випадку [57]. За іншими даними, вона спостерігається у більшості пухлин епітеліального та міоепітеліального походження [49].

Відомо, що утворення порожнин у різних органах в процесі розвитку проходить за участю апоптозу. Гальмування його шляхом надекспресії антиапоптичних білків сім’ї Bcl-2 одночасно іх активацією онкогенів, приводить до заповнення просвіту пухлинними клітинами. Це не відбувається за умов підвищення лише проліферативних процесів [58], що свідчить про існування механізмів, за якими пухлинна клітина сама може гальмувати апоптоз.

Крім зазначених генів у процес підвищення життездатності пухлинних клітин внаслідок гальмування апоптозу залучені і інші, механізми участі яких ще потребують з’ясування. Так, показано, що гіперестрогенія індукує у клітинах агресивних пухлин молочної залози надекспресію гена axl, який індукує клітинну проліферацію та трансформацію. Це подає сигнал до виживання раковим клітинам, попереджуючи їх загибель через апоптоз [59]. Допускають також, що ген ras може приймати участь у контролі апоптичної загибелі клітин. Виключення цієї функції та поява онкогенної властивості у генів сім’ї ras людей, за звичай, активуються точковими мутаціями у кодонах 12, 13 та 61. У пухлинах молочних залоз собак, проте, таких мутацій не виявлено [60], що не виключає можливість генних змін в інших функціональних регіонах ras. До аналогічних висновків прийшли і інші, які не виявили у 10 пухлинах молочної залози собак жодної мутації у генах сім’ї ras [39]. Ці дані суттєво відрізняються від тих, що одержані на відповідних пухлинах людини та різних експериментально індукованих пухлинах у тварин [3], де точкові мутації генів сім’ї ras є дуже частими.

Маловивченими, але не менш важливими для розвитку злоякісних трансформацій, є процеси гальмування апоптозу у результаті порушень його ефекторних механізмів і шляхів передачі проапоптичних сигналів. На прикладі промієлоцитарного лейкозу показана можливість такого механізму. Транслокація, в результаті якої відбувається злиття гена pml (хромосома 15) із геном рецептора ретиноєвої кислоти (хромосома 17), приводить до продукції хімерного білка, який зв’язує шляхи передачі транскрипційного сигналу гена ретиноєвої кислоти та індукує вихід одного із білків з ядерних тілець. У нормі цей білок локалізується у цих специфічних ядерних структурах і це є важливим для модуляції як каспазо-залежних, так і каспазо-незалежних шляхів апоптоза. Онкобілки, які кодуються хімерним геном all/bcr, що виникає внаслідок генної транслокації, є ланками у порушенні передачі проапоптичних сигналів, які виникають при активації Fas. Відбувається це шляхом блокади гена bax та затримці вивільнення цитохрома С із мітохондрій.

Спонтанні рецидивні мутації lpr та gld, які були описані для лабораторних мишей, є відповідно мутаціями генів fas та fasL, що приводить до втрати функціональної активності відповідних білків. Виживання таких клітин дозволяє їм накопичувати мутації, які викликають злоякісну трансформацію [12]. Крім мутацій у генах fas та fasL, причиною стійкості клітини до Fas-залежного апоптозу може бути підвищена продукція цими клітинами розчинної форми Fas; збільшення рівня якої має місце за умов деяких злоякісних пухлин [61]. Як вказано вище, перехід мембранозв’язаної форми Fas у розчинну відбувається за активації металлопротеаз, експресія інгібітору цих ферментів збільшена у клітинах карцином молочної залози [62]. З цим узгоджується думка, що підвищення активності інгібіторів металлопротеаз є фактором, що сприяє інвазії пухлин молочної залози [63].

Відомо, що підтримання довжини теломери відбувається завдяки діяльності теломерази, активність якої у нормі відсутня або низька внаслідок дії білка, який зв’язаний з теломерою і має функцію інгібітора теломерази. Зв’язок цього білка із ДНК регулюється ферментативний комплексом танкіраза-полі(АДФ-рібозо)полімераза. Зміни механізму підтримання довжини теломери внаслідок дії каспаз на останній фермент може бути фактором, що приведе до збільшення тривалості життя старої клітини, яка вичерпала свій ресурс, та до канцерогенезу [64]. Встановлено, що у 95% пухлин активність теломерази є значно підвищеною [65]. У зразках пухлин молочної залози собак спостерігається позитивна кореляція між активністю теломерази та рівнем проліферативної активності PCNA [66].

Одним із ключових механізмів розвитку пухлинного процеса є зниження протипухлинного імунного нагляду. З огляду на це, цікавими є дані про експресію на клітинах деяких солідних пухлин FasL. Це сприяє знищенню клітин, що експресують Fas, зокрема цитотоксичних Т-лімфоцитів та природніх клітин-кілерів. Цей механізм вважають основою відбиття пухлинними клітинами імунної атаки. В той же час, експресія Fas на самих пухлинних клітинах є зниженою, більш того, ряд авторів акцентує, що появі на пухлинних клітинах FasL передує зникнення Fas з цих клітин [67]. Крім того, у разі експресії FasL на пухлинних клітинах його розчинна форма може надходити до циркуляції і провокувати клітини, які мають на своїй поверхні Fas, викликаючи мультиорганні ураження, що часто спостерігаються за умов онкопатології. Вважають, що в тих пухлинах, клітини яких експресують і Fas, і FasL, спостерігається апоптоз, який може приводити навіть до повного відторгнення пухлини [68].

Спонтанно апоптоз зустрічається у пухлинах за умов затримки їх росту [6]. Це пов’язано із явищами ішемії, інфільтрації цитотоксичними лімфоцитами, вивільненням TNF та дією інших цитокінів, зокрема інтерлейкінів, а також опроміненням і хіміотерапевтичних препаратів. Апоптоз, що відбувається незакономірно може бути результатом дії у популяції злоякісних пухлин ауторегуляторних механізмів, що контролюють ріст нормальних клітин [1].

При з’ясуванні питання, чи є апоптоз пізнім явищем в онкогенезі, чи він зустрічається на ранніх його стадіях, експериментально встановлено, що порушення цього процесу має значення вже на самих початкових етапах як вірусного, так і хімічного канцерогенезу. З цих спостережень зроблено висновок, що патологічні зміни молекулярної регуляції апоптозу є інтегральним компонентом багатоетапного процесу канцерогенезу [54].

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. –  192 с.
2. Фильченков А.А., Стойка З.С. Апоптоз и рак. – К.: Морион, 1999. – 187 с.
3. Watzinger F., Mayr D., Gamerith R. Et al. Comparative analisis of ras proto-oncogene mutation in selected mammalian tumor // Mol. Carcinog. – 2001. – 30, N 4. – P. 190-198.
4. Pena L., Perez-Alenza M.D., Rodriguez-Bertos A., Nieto A. Canine inflammatory mammary carcinoma: histopathology, immunohistochemistry and clinical implications of 21 cases // Breast Cancer Res. Treat. – 2003. – 78, N 2. – P. 141-148.
5. Потоцький М.К., Шувалова Н.І., Шестяєв А.Н. Патоморфологічна характеристика злоякісних пухлин собак // Ветеринарна медицина України – 2003. – № 2. – С. 27-28.
6. Kerr I., Harmon B. Definition and incidence of apoptosis: an historical perspective/ // Apoptosis: The Molecular Basis of the Cell Death (Eds. Tomei L. and Cope F.). – Cold Spring Harbor, NY., 1991. – P. 5-29.
7. Katsen A., Vollmar B., Mestres-Ventura P. et al. Cell surfase and nuclear changes during TNF-(alpha)-induced apoptosis in WEHl 164 murine fibrosarcoma cells. A correlative light, scanning, and transmission electron microscopical study // Virchows Arch. – 1998. – 433, N 2. – P. 75-83.
8. Paus R., Menrad A., Czarnetzki B. Neurobiologie der Haut: Apoptose // Hautarzt. – 1995. – 46, N 3. – S. 285-303.
9. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в регуляции клеточного равновесия // Клин. лаб. диагностика. – 2002. – № 11. – С. 25-32.
10. Susin S., Zamzami N., Castedo M. et al. The central executioner of apoptosis: multiple connection between protease activation and mitochondria in Fas/APO-1/CD95 – and ceramide-inducing apoptosis // J. Exp. Med. – 1997. – 186, N 1. – P. 25-37.
11. Белушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Архив патол. – 2001. – № 1. – С. 51-60.
12. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии // Вопросы биол., мед. и фармацевт. химии. – 1999. – № 3. – С. 3-17.
13. Bonavida B., Ng C., Jazirehi A. et al. Selectivity of TRAIL-mediated apoptosis of cancer cells and synergy with drugs: the trail to non-toxic cancer therapeutics // Int. J. Oncol. – 1999. – 15, N 4. – P. 793-802.
14. Schneider P., Holler N., Bodmer J. et al. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity // J. Exp. Med. – 1998. – 187, N 8. – P. 1205-1213.
15.  Kirchholff S., Krueger A., Krammer P. Apoptosis. A brief introduction // Apoptosis. Catalog Merck Biosciences. – 2002/2003. – P. 18-25.
16. Boldin M., Varfolomeev E., Pancer Z. et al. A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APO1 contains a sequence motif related to the death domain // J. Biol. Chem. – 1995. – 270, N 14. – P. 7795-7798.
17. Kischkel F., Lawrence D., Tinel A. et al. Death receptor recruitment of endogenous caspase-10 and apoptosis initiation in the absence of caspase-8 // J. Biol. Chem. – 2001. – 276, N 49. – P. 46639-46646.
18. Duan H., Dixit V. RAIDD is a new “death” adaptor molecule // Nature. – 1997. – 385, N 6611. – P. 86-89.
19. Krueger A., Baumann S., Krammer P., Kirchhoff S. FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis // Mol. Cell Biol. – 2001. – 21, N 24. – P. 8247-8254.
20. Kataoka T., Schroter M., Hahne M. et al. FLIP prevents apoptosis induced by death receptors but not by perforin/granzyme B, chemotherapeutic drugs, and gamma irradiation // J. Immunol. – 1998. – 161, N 8. – P. 3936-3942.
21. Conroy L., Alexander D. The role of intracellular signalling pathways regulating thymocyte and leukemic T cell apoptosis // Leukemia. – 1996. – 10, N 9. – P 1422-1435.
22. Лихтенштейн А.В., Шапот В.С. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы // Патол. физиол. – 1997. – № 3. – С. 35-48.
23. Mayr B., Schaffner G., Kurzbauer R. et a.l Sequence of an exon of tumour suppressor p53 gene – a comparative study in domestic animals: mutation in a feline solid mammary carcinoma // Br. Vet. J. – 1995. – 151, N 3. – P. 325-329.
24. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. – 2000. – 65, № 1. – С. 5-33.
25. Kastan M., Canmain S., Leonard C. P53, cell cycle control and apoptosis: implication for cancer // Cancer Metastasis Rev. – 1995. – 14, N 1. – P. 3-15.
26. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. – 2000. – 65, № 1. – С. 34-47.
27. Oh S., Im M. The p53 mutation which abrogates trans-activation while maintaining its growth-suppression activity // Mol. Cells. – 2000. – 10, N 4. – P. 386-391.
28. Talanian R., Yang X., Turbov J. et al. Granule-mediated killing: pathways for granzyme B-initiated apoptosis // J. Exp. Med. – 1997. – 186, N 8. – P. 1323-1331.
29. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Патол. физиол. и эксперим. терапия. – 1998. – № 2. – С. 38-48.
30. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nat. Med. – 1997.- 3, N 6. – P. 614-620.
31. Shuler M., Maurer U., Galdstein J. et al. p53 triggers apoptosis in oncogene-expressing fibroblasts by the induction of Noxa and mitochondrial Bax translocation // Cell Death Differ. – 2003. – 10, N 4. – P. 451-460.
32. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Роль генов р53 и bcl-2 в апоптозе и лекарственной резистентности опухолей // Вопросы онкологии. – 2000. – 46, № 2. – С. 121-128.
33. Humlova Z. Protooncogene bcl-2 in process of apoptosis. // Sb. Lek. – 2002. – 103, N 4. – P. 419-425.
34. Antonsson B., Montessuit S., Sanchez B., Martinou J. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells // J. Biol. Chem. – 2001. – 276, N 15. – P. 11615-11623.
35. Waterhouse N., Green D. Mitochondria and apoptosis: HO₂ or high-security prison // J. Clin. Immunol. – 1999. – 19, N 6. – P. 378-387.
36. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. An APAF-1-cytochrome C multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9 // J. Biol. Chem. – 1999. – 274, N 17. – P. 11549-11556.
37. Chu L., Putteman G., Kong J. et al. Genomic organization of the canine p53 gene and its mutational status in canine mammary neoplasis // Breast Cancer Res. Treat.- 1998. – 50, N 1. – P. 11-25.
38. Veldhoen N., Watterson J., Brash M., Milner J. Identification of tumour-associated and germ line p53 mutations in canine mammary cancer // Br. J. Cancer – 1999. – 81, N 3. – P. 409-415.
39. Mayr B., Dressler A., Reifinger M., Feil C. Cytogenetic alterations in eight mammary tumors and tumor-suppressor gene p53 mutation in one mammary tumor from dogs // Am. J. Vet. Res. – 1998. – 59, N 1. – P. 69-78.
40. Mayr B., Reifinger M., Alton K. Novel canine tumour suppressor gene p53 mutations in cases of skin and mammary neoplasms // Vet. Res. Commun. – 1999 – 23, N 5. – P. 285-291.
41. Muto T., Wakui S., Takahashi H. et al. p53 gene mutations occurring in spontaneous benign and malignant mammary tumors of the dog // Vet. Pathol. – 2000. – 37, N 3. – P. 248-253.
42. Setoguchi A., Sakai T., Okuda M. et al. Aberrations of the p53 tumor suppressor gene in various tumors in dogs // Am. J. Vet. Res. – 2001 – 62, N 3. – P. 433-439.
43. Van Leeuwen I., Hellmen E., Cornelisse C. et al. P53 mutations in mammary tumor cell lines and corresponding tumor tissues in the dog // Anticancer Res. – 1996. – 16, N 6B. – P. 3737-3744.
44. Gamblin R., Sagartz J., Couto C. Overexpression of p53 tumor suppressor protein in spontaneously arising neoplasms of dogs // Am. J. Vet. Res. – 1997. –58, N 8. – P. 857-863.
45. Nasir L., Krasner H., Argyle D., Williams A. Immunocytochemical analysis of the tumour suppressor protein (p53) in feline neoplasia // Cancer Lett. – 2000. – 155, N 1. – P. 1-7.
46. Haga S., Nakayama M., Tatsumi K.et al. Overexpression of the p53 gene product in canine mammary tumors // Oncol. Rep. – 2001. – 8, N 6. – P. 1215-1219.
47. Rungsipipat A., Tateyama S., Yamaguchi R. et al. Immunohistochemical analysis of c-yes and c-erbB-2 oncogene products and p53 tumor suppressor protein in canine mammary tumors // J. Vet. Med. Sci. – 1999. –61, N 1. – P. 27-32.
48. Wakui S., Muto T., Yokoo K. et al. Prognostic status of p53 gene mutation in canine mammary carcinoma // Anticancer Res. – 2001. – 21, N 1B. – P. 611-616.
49. Inoue M., Shiramizu K. Immunohistochemical detection of p53 and c-myc proteins in canine mammary tumours // J. Comp. Pathol. – 1999. – 120, N 2. – P. 169-175.
50. Murakami Y., Tateyama S., Rungsipipat A. et al. Immunohistochemical analysis of cyclin A, cyclin D1 and P53 in mammary tumors, squamous cell carcinomas and basal cell tumors of dogs and cats // J. Vet. Med. Sci. – 2000 – 62, N 7. – P. 743-750.
51. Soussi T. Analyse multifaktorille des alterations du gene p53 dans les cancers // Publ. Assoc. vanciens eleves Ins. Pasteur. – 1994. – 36, N 1. – P. 61-64.
52. Setoguchi A., Okuda M., Nishida E. et al. Results of hyperamplification of centrosomes in naturally developing tumors of dogs // Am. J. Vet. Res. – 2001 –62, N 7. – P. 1134-1141.
53. Madewell B., Gandour-Edwards R., Edwards B. et al. Topographic distribution of bcl-2 protein in feline tissues in health and neoplasia // Vet. Pathol. – 1999 –36, N 6. – P. 565-573.
54. Бутенко З.А. Онкогены – регуляторы апоптоза в механизмах лимфо- и канцерогенеза // Эксперим. онкология. – 176, № 3. – С. 165-171.
55. Fan S., Wang J., Yuan R. et al. Scatter factor protects epithelial and carcinoma cells against apoptosis induced by DNA-damaging agents // Oncogene – 1998. – 17, N 2. – P. 131-141.
56. Finke J., Lange W., Mertelsmann R. et al. Bcl-2 induction is part of the strategy of Epstein-Barr virus // Leukemia Lymphoma. – 1994. – 12. – P. 413-419.
57. Engstrom W., Barrios C., Azawedo E. et al. Expression of c-myc in canine mammary tumuors // Anticancer Res. – 1987. – 7, N 6. – P. 1235-1237.
58. Debnath J., Mills K., Collins N. et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini // Cell. – 2002. – 111, N 1. – P. 29-40.
59. Berclaz G., Altermatt H., Rohrbach V. et al. Estrogen dependent expression of the receptor tyrosine kinase axl in normal and malignant human breast // Ann. Oncol. – 2001. – 12, N 6. – P. 819-824.
60. Castagnaro M. Ras gene analysis in mammary tumors of dogs by means of PCR-SSCP and direct genomic analysis // Ann. Ist. Super. Sanita – 1995. – 31, N 3. – P. 337-341.
61. Jodo S., Kobayafhi S., Nakajima Y et al. Elevated serum levels of a soluble FAS/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma // Clin. exp. Immunol. – 1998. – 112, N 2. – P. 166-171.
62. Giang Y., Wang M., Celiker M. et al. Stimulation of mammary tumorigenesis by systemic tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 4 gene delivery // Cancer Res. – 201. – 61, N 6. – P. 2365-2370.
63. Shao Z., Shen Z., Liu C. et al. Curcumin exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells // Int. J. Cancer. – 2002. – 98, N 2. – P. 234-240.
64. Aragona M., Pontoriero A., Panetta S. et al. The role of telomere-binding proteins in carcinogenesis // Minerva Med. – 2000. – 91, N 11-12. – P. 299-304.
65. Yazawa M., Okuda M., Setoguchi A. et al. Telomere length and telomerase activity in canine mammary gland tumors // Am. J. Vet. Res. – 2001. – 62, N 10. – P. 1539-1543.
66. Funakoshi Y., Nakayama H., Uetsuka K. et al. Cellular proliferative and telomerase activity in canine mammary gland tumors // Vet. Pathol. – 2000. – 37, N 2. – P. 177-183.
67. Pinkoski M., Green D. Cloak and dagger in the avoidance of immune surveillance // Curr. Opin. Genetics and Development. – 2000. – 10. – P. 114-119.
68. Seino J., Kayayaki N., Okumura K., Yagita H. Antitum effect of locally produced CD95-ligand // Nat. Med. – 1997. – 3. – P. 165-170.

Схема основних сигнальних шляхів та механізмів реалізації апоптозу (пояснення у тексті).