Microsvit

Життя у мікроскопі …

Фрагментація ДНК у тканинах новоутворень молочної залози собак

лютого 16, 2013

За сучасними уявленнями апоптоз є загальнобіологічним механізмом, який відповідає за підтримку сталої чисельності клітинної популяції, а також вибраковку дефектних клітин [1]. Ця участь апоптозу у механізмах росту тканин та звільнення їх від трансформованих клітин по суті відображає його контролюючу роль у розвитку новоутворень, у т.ч. і злоякісних [2]. Інтенсивні дослідження апоптозу призвели до формування уявлень про множинність пускових і регуляторних механізмів передачі апоптичного сигналу та єдність заключних етапів апоптозу [2, 3]. Його термінальною фазою є деградація ДНК, яка проходить у декілька етапів з формуванням все більш мілких фрагментів. Найбільш повно вивчена міжнуклеосомна дезінтеграція ДНК, внаслідок якої утворюються фрагменти, що кратні за величиною 180-190 пар основ і відповідають довжині нитки ДНК у межах однієї нуклеосоми. За умов електрофоретичного розділення полідезоксирибонуклеотидних фрагментів, які екстрагують з клітин, вони утворюють характерну ”драбинку”, що відображає дискретний характер міжнуклеосомних розривів. При цьому неможливість кількісного визначення фрагментованої ДНК є недоліком цього методу [2].

Фрагментація ДНК має місце і за умов некротичної загибелі клітин. У цьому випадку вона проходить із утворенням випадкового набору низькомолекулярних фрагментів, тому на електрофореграмах виявляється єдина дифузна пляма ДНК. Як метод скринінгової загальної оцінки інтенсивності фрагментації ДНК використовують кількісне спектрофотометричне визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів (низькомолекулярних фрагментів ДНК) [4].

Злоякісні пухлини молочної залози людини відносять до пухлин, які мають середній рівень апоптичного індексу [3]. Виявлений значний взаємозв’язок між його величиною та гістологічною будовою пухлини, ступенем її злоякісності, мітотичною активністю. Є дані про те, що у тканині неінфільтруючого внутрішньопротокового раку молочної залози спостерігається певна кореляція між інтенсивністю загибелі пухлин шляхом некрозу та апоптозу. В той же час вважають, що пухлини людини характеризуються, як правило, більш високим апоптичним індексом, ніж пухлини тварин [3]. Дані про інтенсивність загибелі клітин спонтанних пухлин молочної залози собак у літературі вкрай обмежені.

Метою роботи є визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у тканині різних за гістологічною будовою новоутворень молочної залози собак.

Концентрацію низько- та високомолекулярної ДНК встановлювали у тканині 42 зразків новоутворень молочної залози, які були отримані за умов їх хірургічного видалення в Оболонській та Печерській державних лікарнях ветеринарної медицини м. Києва. За контроль слугувала непухлинна тканина молочних залоз собак, що із різних причин були відбраковані у Київському притулку для тварин (с.Баришівка). Гістологічний діагноз щодо новоутворень виставляли за Міжнародною гістологічною класифікацією пухлин молочних залоз ВОЗ [5]. Концентрацію низькомолекулярних фрагментів ДНК визначали у надосадовій рідині після лізісу клітин за умов гомогенізації тканини в 0,01 М Na-ЕДТО-трис-HCl буфері рН 7,8 із 0,5% тритону Х-100 [4]. Осад за цих умов містив високомолекулярну ДНК у складі нативного хроматину. Кількісний вміст ДНК в обох фракціях визначали за реакцією із дифеніламіном [6]. Одержані дані оброблені статистично із використанням критерію t Стьюдента.

Серед 42 зразків новоутворень, які були досліджені у цій роботі, у 27 випадках діагностували злоякісні пухлини, у 15 – фіброзно-кістозну хворобу (дисплазію) молочних залоз. Група злоякісних пухлин була представлена дольковим інфільтруючим раком (8 випадків), протоковим інфільтруючим раком (2), раком із метаплазією (9), внутрішньопротоковим раком (8) та дольковим раком in situ (2).

Як видно із даних таблиці, загальний вміст ДНК у тканині злоякісних та доброякісних новоутворень молочної залози собак не відрізнявся від такого у непухлинній тканині. В той же час у злоякісних пухлинах концентрація низькомолекулярної (фрагментованої) ДНК була зниженою, а рівень високомолекулярної ДНК у складі нативного хроматину підвищеним. Внаслідок таких модуляцій вмісту низько- та високомолекулярної ДНК відносна частка фрагментованої ДНК у злоякісних пухлинах була суттєво (на 35%) меншою, ніж у непухлинній тканині молочних залоз собак. Звертає на себе увагу той факт, що зміни вмісту різних фракцій ДНК, які були зафіксовані для загальної групи злоякісних пухлин, відбувалися переважно за рахунок змін у пухлинах, що відносять до інфільтруючих раків (протоковий, дольковий, рак із метаплазією). Модуляції вмісту низько- та високомолекулярної ДНК у пухлинах неінфільтруючих раків були менш значними, проте відсоток фрагментованої ДНК також був меншим (на 23%), ніж у контролі. Різниця між відсотком фрагментованої ДНК у пухлинах інфільтруючих та неінфільтруючих раків молочної залози собак виявилася вірогідною (Р<005, таблиця).

Отримані дані щодо зменшення долі фрагментованої ДНК у тканині злоякісних пухлин молочної залозисобак може непрямо свідчити про зниження інтенсивності загибелі трансформованих клітин. Крім того, збільшення рівня високомолекулярної ДНК у складі нативного хроматину певно вказує на підвищену проліферативну активність клітин. Вважають, що порушення співвідношення між процесами проліферації та загибелі трансформованих клітин є важливим у формуванні пухлинних клонів [7]. У проведених дослідженнях найбільш виразно це спостерігалося для пухлин інфільтруючих раків у порівнянні із неінфільтруючими. Досліджуючи значення гормональних зрушень під час естрального циклу у щурів у розвитку злоякісної трансформації було показано, що на піку проліферативної активності епітелію молочної залози рівень апоптичної загибелі клітин був зменшеним [8]. В той же час в експериментально індукованих пухлинах молочної залози щурів неопластична трансформація клітин епітелію асоціювалася зі зниженням кількості апоптичних клітин, але не із підвищенням клітинної проліферації [9].

Слід зазначити, що і за умов дисплазії також мало місце зниження відносного вмісту фрагментованої ДНК (на 21%), хоча вірогідно значущих змін рівня низько- і високомолекулярної ДНК при цьому відмічено не було, як і у випадку неінфільтруючих раків (таблиця). З огляду на це важливою здається думка, яка все більше утверджується в літературі, про те, що гіпер- та диспластичні процеси можуть розглядатися як рання стадія канцерогенезу [7].

Отже результати попередніх скринінгових досліджень щодо визначення відносного вмісту фрагментованої ДНК у тканині різних за гістологічною будовою злоякісних новоутворень молочної залози собак дозволяє висловити думку про зниження у них і, у меншій мірі у разі дисплазії молочних залоз, інтенсивності фрагментації ДНК. Для уточнення природи (апоптична чи некротична) фрагментації ДНК у клітинах пухлин молочної залози різної гістологічної будови будуть проведені подальші дослідження.

 

  1. Швембергер И.Н., Гинкул Л.Б. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии // Вопросы онкологии. – 2002. – 48, № 2. – С. 153-158.
  2. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак. – Киев: Морион, 1999. – 142 с.
  3. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. –  192 с.
  4. Коваль Т.В., Ковальова В.А., Дворщенко К.О. та ін. Порівняльне дослідження загибелі in vitro тимоцитів за дії іонізуючої радіації та перекису водню // Проблеми екологічної та медичної генетики і клітинної імунології. – Київ-Луганськ-Харьків, 2001, № 7 (39). – С. 119-125.
  5. Гистологическая классификация опухолей молочной железы: Пер. с анг. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1984. – 30 с.
  6. Бартон К. Определение концентрации ДНК с помощью дифениламина / Методы исследования нуклеиновых кислот. – М.: Мир, 1970. – С. 7-9.
  7. Канцерогенез / под редакцией Д.Г. Заридзе. – М.: Медицина, 2004. – 574 с.
  8. Schediu P., Mitrenda T., Kaeck M. Estrous cycle regulation of mammary epithelial cell proliferation, differentiation and death in the Spraque-Dawley rat: a model for investigating the role of estrous cycling in mammary carcinogenesis // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2000. – 5, № 2. – P. 211-225.
  9. Shilkaitis A., Green A., Steele V. et al. Neoplastic transformation of mammary epithelial cells in rats is associated with decreased apoptotic cell death // Carcinogenesis. – 2000. – 21, № 2. – P. 227-233.

Стаття написана у співавторстві з Потоцьким М.К та опублікована у журналі “Доповіді НАН України” за 2005 рік (№ 6, С. 172–175)

Ваша електронна адреса не буде опублікованна. Обов’язкові поля позначені *

*