Вміст ДНК та розмір ядер клітин новоутворень молочних залоз собак

Однією з характерних ознак пухлинних клітин є генетична нестабільність, яка базується на порушенні механізмів точності відтворення генетичного апарату, репарації ДНК та змінах регуляції клітинного циклу [1]. Морфологічно генетична нестабільність реєструється, зокрема, при визначенні за допомогою мікроспектрофотометричних досліджень вмісту ДНК у ядрах клітин та співставленні його з нормальним (диплоїдним) рівнем. Факти про гіперпродукцію ДНК у ядрах клітин тканин, що малігнізують, та накопичення ДНК у процесі канцерогенезу відомі давно. Оцінка вмісту ДНК у ядрах (плоїдність) застосовується у медицині як додатковий критерій при уточненні патологічної діагностики, передусім у верифікації стадій інтраепітеліальної неоплазії, коли з’являються клітини з новими біологічними властивостями [2]. Визначенню плоїдності ядер новоутворень у тварин, зокрема новоутворень молочних залоз собак, присвячена значно менша кількість робіт, результати яких у певній мірі різняться [3, 4].

У ветеринарній практиці рідко застосовується аналіз гістологічних препаратів із застосуванням морфометрії, яка є одним з методів подолання суб’єктивності та підвищення вірогідності досліджень, тоді як у медичній практиці співставлення морфометричних характеристик клітини та ядра вважають найбільш інформативним при диференціальній діагностиці, оцінці стадії патологічного процесу та його прогнозу [5].

Завдання дослідження. Визначити для різних новоутворень молочних залоз собак розміри ядер клітин та вміст в них ДНК.

Матеріал і методи дослідження. Матеріал для досліджень був отриманий з Печерської та Оболонської клінік ветеринарної медицини у м. Києві під час планових операцій з приводу видалення новоутворень молочних залоз собак. Досліджено тканину новоутворень від 63 собак. У групу порівняння (контроль) було включено тканину молочних залоз від 8 собак, які з різних причин були вибраковані у Київському притулку для тварин (с. Баришівка). При огляді патології молочних залоз у цих тварин виявлено не було. Пухлини фіксували 10 % водним розчином формаліну, подальшу обробку матеріалу, фарбування зрізів гематоксиліном Караці та еозином, а також реакцію Фeльгена проводили за загальноприйнятими схемами. Гістологічні типи новоутворень визначали за Міжнародною гістологічною класифікацією пухлин молочної залози ВООЗ [6]. Кількісний розподіл пухлин дослідженої вибірки після визначення їх гістологічного типу наведено у таблиці 1.

Морфометричні дослідження площі ядер проводили за допомогою обробки серійних напівтонких зрізів на системі аналізу зображень “IBAS-200” фірми “Kontron” (Німеччина), яка включала світлооптичний мікроскоп, кольорову відеокамеру та комп’ютер. Мікроскопію проводили при збільшенні 800. Межі ядер виділяли вручну за допомогою „миші” при контролі процесу на моніторі. У кожному препараті аналізували від 20 до 50 клітин залежно від якості та об’єму матеріалу [7].

Інтенсивність реакції Фельгена у фіксованих препаратах визначали при реєстрації насиченості кольору, що виникає при взаємодії альдегідних груп, які після м’якого гідролізу стають доступними для реакції, з реактивом Шиффа. Насиченість кольору реєстрували за допомогою кольорової моделі HSB, яка описує якість світлових хвиль. За цієї моделі насиченість є чистотою кольору і являє собою різницю між довжиною домінуючої хвилі та інших. Насиченість кольору визначали за допомогою комп’ютерної програми Adode Photoshop 5.0 на сканованих фотографіях гістологічних препаратів та виражали у відсотках від інтенсивності чистого кольору. За цим показником можна непрямо оцінити вміст ДНК у ядрах новоутворень молочних залоз собак. На кожному препараті аналізували випадкову вибірку у 50 ядер.

Одержані дані опрацьовані статистично з використанням критерію t Стьюдента. Критичний рівень значимості приймали за 0,05.

Результати дослідження.

Площа ядер клітин майже усіх досліджених злоякісних пухлин була більшою, ніж у нормі (табл. 2). Найбільш суттєвими ці зміни виявлені у анапластичній (на 164 %), неінфільтративній (in situ) (на 63 %), простій солідній (на 54 %) карциномах та карциносаркомі (на 49 %), найменшими – у хондросаркомі (на 15 %) та карциномі в аденомі (на 12 %). Ядра клітин саркоми в аденомі виявилися зменшеними у порівнянні з нормальними розмірами (на 23 %), а у веретеноклітинній карциномі за площею вірогідно не відрізнялися від них.

За умов дисплазії ядра клітин молочних залоз були більшими, ніж у нормі на 19 %, а у доброякісних пухлинах не відрізнялися від останньої.

Проведені дослідження (табл. 2) показали, що у порівнянні з вмістом ДНК у ядрах клітин тканини нормальних молочних залоз собак кількість її у ядрах клітин неінфільтративної (in situ), складної, простої карцином та карцином спеціальних типів була збільшеною (на 21%, 49%, 51% та 18% відповідно). Серед простих карцином найбільший вміст ДНК мав місце у разі анапластичної, а найменший – у тубулопапілярній карциномі (підвищення склало 30%, 54% та 80% відповідно у тубулярній, солідній та анапластичній). Підвищений рівень ДНК у ядрах клітин карцином спеціальних типів спостерігався за рахунок веретеноклітинної карциноми (на 29%), тоді як у плоскоклітинній карциномі величина вмісту ДНК була співставима з нормальним рівнем ДНК (див. табл. 2). У ядрах клітин доброякісних пухлин і у разі дисплазії вміст ДНК був збільшеним в однаковій мірі (на 36% та 32%).

Отже, проведені дослідження свідчать про підвищений вміст ДНК в ядрах клітин доброякісних та більшості злоякісних новоутворень молочних залоз собак, що підтверджує факт накопичення ДНК в ядрах у разі трансформації клітин. Нестабільний профіль ДНК у клітинах карцином та доброякісних змішаних пухлин молочних залоз собак був показаний за застосування проточної цитометрії та при дослідженні хромосом [8, 9, 10]. Більш ніж третина злоякісних новоутворень молочних залоз собак були анеуплоїдними. Серед різних злоякісних пухлин не встановлено суттєвої різниці у вмісті ДНК в ядрах; відмічено лише, що у тубулярних карциномах вміст його відповідав диплоїдному. В цих дослідженнях ступінь ДНК-плодії у первинних пухлинах не була пов’язана ні з розмірами пухлин, ні з гістологічним типом пухлин, ні з станом ядер пухлинних клітин.

У наших дослідженнях встановлено, що серед карцином найменший підйом рівня ДНК в ядрах клітин був у неінфільтративній (in situ) карциномі, яка є найменш злоякісною [11], а найвищий – у низькодиференційованій анапластичній карциномі, яка характеризується значним метастатичним потенціалом. Це співпадає з висновком, що більш значне підвищення вмісту ДНК в ядрах клітин характерно для біологічно активніших пухлин [12]. Серед простих карцином найменш значне підвищення вмісту ДНК в ядрах мало місце у тубулопапілярній карциномі і це відповідає результатам спектрофотометричних досліджень щодо диплоїдності більшості ядер тубулярних карцином молочних залоз собак, а також тим, в яких було показано, що індекс проліферації у тубулярних карциномах молочних залоз собак був меншим, ніж у солідних [10, 13]. Виявлена певна різниця у вмісті ДНК в ядрах клітин різних карцином спеціальних типів, в той же час її не встановлено у збільшенні вмісту ДНК серед різних типів сарком. Звертає на себе увагу значне підвищення вмісту ДНК у ядрах клітин карциносарком та карцином або сарком у доброякісній пухлині. Наші дослідженні не дозволяють визначити точну величину плоїдності, проте підтверджують дані літератури про те, що значна кількість злоякісних новоутворень молочних залоз собак є анеуплоїдними [9, 10].

У деяких роботах, присвячених вивченню біологічних особливостей раку молочних залоз людини, було показано, що одночасно з підвищенням у ядрах вмісту ДНК у пухлині кількісно зростає і популяція клітин з ядрами більших розмірів [12]. В наших дослідженнях при порівнянні цих параметрів з’ясовано, що спостерігається певний паралелізм у збільшенні розмірів ядер клітин деяких типів пухлин молочних залоз собак та вмістом у них ДНК (неінфільтративна (in situ), складна, проста карциноми та карциносаркома), в той час як для сарком, карцином спеціальних типів та у разі карцином/сарком у доброякісних пухлинах такого зв’язку не відмічено. Наявність високої плодії у сполученні з вираженою гетерогенністю клітинних популяцій вважають прогностично несприятливим фактором [12]. Відмічають, проте, що у деяких пухлинах має місце внутрішньопухлинна плодія, яка не залежить від гістологічної гетерогенності ядер [9].

У доброякісних пухлинах та за умов дисплазії рівень ДНК в ядрах клітин був вищим, ніж у нормі, що вказує на певний потенціал цих новоутворень до малігнізації; за дисплазії був підвищеним також і розмір ядер їх клітин (див. табл. 2). У літературі свідчення про частоту анеуплодії у доброякісних пухлинах різняться: деякі зазначають, що вона присутня у поодиноких пухлинах [10], інші знайшли її майже у п’ятій частині від усіх досліджених доброякісних новоутворень [9]. Збільшення вмісту ДНК у ядрах клітин доброякісних пухлин поряд із підвищенням розмірів ядер вказує на певний потенціал цих новоутворень до злоякісної трансформації. Зважаючи на це, важливою є думка про схильність доброякісних пухлин молочних залоз собак до малігнізації. Динамічні спостереження з цього приводу відсутні, проте, в опису пухлин у першому та другому варіанті Міжнародної класифікації ВООЗ пухлин молочних залоз собак, поряд із твердженням про труднощі у морфологічній діагностиці та класифікації проліферативних уражень молочних залоз, наведена теза: біля 10% доброякісних за гістологічною будовою пухлин з часом (досить тривалим) можуть давати метастази, тобто ставати злоякісними [11, 14].

Близькість величин рівня ДНК у ядрах клітин за умов дисплазії та у разі неінфільтративної (in situ) карциноми підтверджує думку про нечітку онкологічну межу між цими гістологічними станами епітелію. Патогістологічні критерії дисплазії та раку in situ не завжди дають повну уяву у тому, що досліджений зріз є цілком презентабельним для цих стадій патологічного процесу, так як гістологічна картина залежить від місця відбору зразка, від рівня проходження та плоскості зрізу, а також від кількості матеріалу. За наявності даних про плоїдність ядер клітин новоутворень молочних залоз вказані обмеження майже знімаються, так як з’являється можливість адекватної оцінки проліферативних властивостей певних клонів клітин [2].

Висновки.

1. У ядрах клітин усіх злоякісних (за винятком плоскоклітинної карциноми) та доброякісних новоутворень молочних залоз собак рівень ДНК у ядрах підвищено: у найменшій мірі у неінфільтративній (in situ), у найбільшій – в анапластичній карциномі.

2. Відмічений певний паралелізм у збільшенні розмірів ядер клітин неінфільтративної (in situ), складної, простої карцином і карциносарком та вмістом у них ДНК; у саркомах, карциномах спеціальних типів та у разі карцином/сарком у доброякісних пухлинах такого зв’язку не виявлено.

3. Близькість величин рівня ДНК у ядрах клітин за умов дисплазії та неінфільтративної (in situ) карциноми підтверджує думку про нечітку онкологічну межу між ними.

Література

1. Канцерогенез / под редакцией Д.Г. Заридзе. – М.: Медицина, 2004. – 574 с.
2. Автандилов Г.Г. Патогистологическая диагностика предопухолевых процессов и опухолей молочной железы / Автандилов Г.Г., Перов Ю.Л., Григорьева С.Г., Зайратьянц О.В. // Архив патол. – 2001. – Т. 63, вып. 2. – С. 26-30.
3. Destexhe E. Image analysis evaluation of ploidy, S-phase fraction and nuclear area in canine mammary tumours / Destexhe E., Bicker E., Coignoul F. // J. Comp. Pathol. – 1995. – V. 113, № 3. – P. 205-216.
4. Hellmen E. Canine mammary tumour cell lines established in vitro / Hellmen E. // J. Reprod. Fert. – 1993. – Suppl. 47. – P. 489-499.
5. Лушников Е.Ф. Теория и практика морфометрии опухолей человека / Лушников Е.Ф., Загребин В.М. // Архив патол. – 1987. – вып. 12. – С. 3-9.
6. Histological Classification of mammary tumors of the dog and cat / [Misdorp W., Else R., Hellmen E., Lipscomb T.] – 2^nd series, v. Vll. – Armed Forces Inst. Pathol. in cooperation with Amer. Registry of Pathol. and World Health Organization Collaborating Center for World Reference on Compar. Oncol., Washington, DC, 1999. – 58p.
7. Болгова Л.С. Морфометрия в цитологической диагностике степени дифференцировки рака легкого / Болгова Л.С. // Новые приложения морфометрии и математического моделирования в медико-биологических исследованиях. Тез. докл. научно-прак. конф., 9-11 октября 1990 г. – Харьков, 1990. – С. 31.
8. Hellmen E. Characterization of four in vitro established canine mammary carcinoma and one atypical benign mixed tumor cell line / Hellmen E. // In Vivo Cell Dev. Biol. – 1992. – V. 28A, № 5. – P. 309-319.
9. Perez Alenza M. DNA flow cytometry of canine mammary tumours: the relationship of DNA ploidy and S-phase fraction to clinical and histological fetures / Perez Alenza M., Rutteman G., Kuipers-Dijkshoorn N., Pena L., Montoya A., Misdorp W., Cornelisse C. // Res. Vet. Sci. – 1995. – V. 58, № 3. – P. 238-243.
10. Destexhe E. Image analysis evaluation of ploidy, S-phase fraction and nuclear area in canine mammary tumours / Destexhe E., Bicker E., Coignoul F. // J. Comp. Pathol. – 1995. – V. 113, № 3. – P. 205-216.
11. Misdorp W. Tumors of the mammary gland / Misdorp W. // Tumor in domestic animals / Ed. D. Meuten – Iowa State Press, 2002, ed. 4. – P. 575-612.
12. Лобода В.И. Биологические особенности рака молочной железы с различным содержанием ДНК / Лобода В.И. // Вопр. онкол. – 1980. – № 12. – С. 23-27.
13. Funakoshi Y. Cellular proliferative and telomerase activity in canine mammary gland tumors / Funakoshi Y., Nakayama H., Uetsuka K., Nishimura R., Sasaki N., Doi K. // Vet. Pathol. – 2000. – V. 37, № 2. – P. 177-183.
14. International histological classification of tumors of domestic animals // Bull. Word health organization, Geneve. – 1974. – V. 50, № 1-2. – P. 111-133.

Стаття опублікована у Матеріалах ІХ Українського біохімічного з’їзду за 2006 рік.